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氨芐青霉素酶聯免疫試劑盒

說明書

一、藥物概述及檢測原理

 氨芐青霉素類抗生素廣譜的抗菌特性，為動物疾病的防治提供了、低毒的有力武器，被大量應用于畜禽養殖業。人食用了氨芐青霉素殘留的動物源食品會對身體造成一定危害甚至產生嚴重的過敏反應，所以對氨芐青霉素殘留的有效監測已成為保障食品安全的一個重要環節。

操作流程本公司的氨芐青霉素酶聯免疫試劑盒使用zui新生物技術開發，具有方便、快速、靈敏等特點。

本試劑盒利用氨芐青霉素抗體與氨芐青霉素可產生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品（樣本）和氨芐青霉素抗體，樣本或標準品中的氨芐青霉素藥物與固定在酶標板上的抗原競爭氨芐青霉素抗體，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品（樣本）中氨芐青霉素藥物的含量成反比。

二、試劑盒內包含組分：

標準品工作液：0 ppb、0.5 ppb、1.5 ppb、4.5 ppb、13.5 ppb,500ppb，1 mL/瓶。

96孔酶標板：1塊

氨芐青霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）

酶標Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）

2×濃縮復溶液：1瓶（60mL/瓶）

底物A液：1瓶（7 mL/瓶）

底物B液：1瓶（7 mL/瓶）

終止液：1瓶（7mL）

說明書

蓋板膜

自封袋

三、用戶需要自備的設備和試劑

儀器：

v 酶標儀（檢測波長450 nm、630 nm）

v 電子天平（精度：0.01 g）

v 離心機（4000 g及以上）

v 生化培養箱（可調25℃）

v 搖床

v 旋渦振蕩器

v 氮吹儀

v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）

v 計時器

試劑：

v 乙腈

v 氫氧化鈉

v 正己烷

v 去離子水

四、試劑盒特異性

　　　試劑盒與其他藥物的交叉反應率：

v 氨芐青霉素…………………………………100%

五、樣本檢測步驟

1. 工作液準備

v  0.1M 氫氧化鈉溶液(組織提取用)：稱取0.4g氫氧化鈉加入100ml去離子水溶解混勻。

v 乙腈-0.1M 氫氧化鈉溶液(組織提取用)： 量取84ml乙腈加入16ml 0.1M 氫氧化鈉溶液中，混勻。

v 復溶工作液：取1份2×濃縮復溶液加去離子水1份按照1:1的比例稀釋即得。

v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

2. 樣品前處理

組織方法一（雞肉、豬肉、魚、蝦）（稀釋倍數：4）   

Ø 用均質器均質組織樣本；

Ø 稱取1±0.05g均質后的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中， 加入4ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液（見5.1），用振蕩器振蕩10min，3000g室溫離心10min；

Ø 移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃管中，于60℃水浴氮氣流下吹干；

Ø 加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s，溶解干燥殘留物，再加入1ml復溶工作液（見5.2），用渦旋儀渦動30s，充分混勻后轉入2ml聚苯乙烯離心管中，3000g室溫離心5min；

Ø 除去上層有機相，取下層50μL 用于分析。

Ø 注：批量檢測樣本時使用本公司代理配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷。

組織方法二（雞肉、豬肉、魚、蝦）（稀釋倍數：20）   

Ø 用均質器均質組織樣本；

Ø 稱取1±0.05g均質后的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中， 加入4ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液（見5.1），用振蕩器振蕩10min，3000g室溫離心10min；

Ø 移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃管中，于60℃水浴氮氣流下吹干；

Ø 加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s，溶解干燥殘留物，再加入1ml復溶工作液（見5.2），用渦旋儀渦動30s，充分混勻后轉入2ml聚苯乙烯離心管中，3000g室溫離心5min；

Ø 除去上層有機相，取下層水相與復溶工作液（見5.2）按1：4體積比進行稀釋（50μL樣本液+200μL復溶工作液）；

Ø 取50μL用于分析。

Ø 注：批量檢測樣本時使用本公司代理配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷。

3. 檢測

Ø 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，并記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標準品點兩孔），未使用的酶標板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環境中以防變質；

Ø 加樣：向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，向每孔中加入50 μL抗體工作液；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應30 min；

Ø 洗滌：取出酶標板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后，將酶標板倒置于吸水紙上，用力拍干；

Ø 加樣：向每孔中加入100 μL酶標二抗工作液；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應30 min；

Ø 洗滌：取出酶標板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后，將酶標板倒置于吸水紙上，用力拍干；

Ø 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效）；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應15 min；

Ø 終止：在反應后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。

Ø 讀數：終止后的酶標板應在5 min內用酶標儀讀數，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。

4. 計算結果

Ø 設各標準品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標準（濃度為0 ppb的標準品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標準品（或樣品）對應的吸光度的百分比：

Ø 使用半對數系統代入標準品對應的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。

Ø 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，后乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。

六、試劑盒參數

Ø 試劑盒靈敏度：0.5ppb；

Ø 標準曲線范圍：0.5ppb-13.5ppb；

Ø 板內變異系數：<5%；

Ø 板間變異系數：<15%；

Ø B0吸光度zui佳值：>0.8；

Ø 回收率：60%±20%

Ø 樣品低檢測限：

　組織方法一……………………………約3ppb

  組織方法二……………………………約10ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限制

本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、試劑盒貯存條件

試劑盒ZUI佳貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。

未使用完的酶標板條須密封保存2-8℃的環境中。

九、注意事項

使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書。

試劑盒使用前，需將盒內各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。

試劑在使用前許搖勻，混合時應避免出現氣泡。

槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復使用。

請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結果。

底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合后立即變藍，說明試劑已污染或變質。

加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產生影響。

終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎ru眼，請在*清洗后去醫院檢查。