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                   卡那霉素快速檢測試劑盒

使用說明書

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被卡那霉素偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物卡那霉素和微孔條上預包被的卡那霉素偶聯(lián)抗原競爭卡那霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物卡那霉素的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物卡那霉素的含量。

【試劑盒技術指標】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間：45min

樣本定量檢測下限

組織(豬肉/肝 雞肉/肝 /水產）………………………2ppb

蜂蜜 ………………………………………………… 2ppb

牛奶 ………………………………………………… 2ppb

交叉反應率

卡那霉素……………………………………………100%

卡那霉素……………………………………………  <0.1%

雙氫卡那霉素………………………………………… <0.1%

樣本回收率

組  織……………………………………………85±10%

蜂蜜 ……………………………………………85±10%

牛奶 …………………………………………  85±10%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標記物       7ml………………………紅色帽

5、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

8、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

10、 2X 濃縮復溶液  50ml ·……………… 藍色帽

【所用儀器、試劑】   

儀器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O、NaCl

【實驗前溶液配制】

配液1、0.02M PBS緩沖液         5.16gNa2HPO4*12H2O+0.87gNaH2PO4*2H2O

        +8.5gNaCl，加入蒸餾水至1000ml）用于樣品提取液的配制。

配液2、 1X復溶液

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份2X濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本提取后的復溶)。

配液3、1X洗滌液

將20X濃縮洗滌液用去離子水按 1：19稀釋（1份20X濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

(a)組織(豬肉/肝 雞肉/肝 /水產）/蜂蜜樣本前處理方法

1、 取2±0.05g樣本與4ml 0.02MPBS緩沖液混合5min，置56℃水浴環(huán)境放置15min；

2、 3000g以上，室溫離心5min；

3、 取50µl上清液，加入450µl  的1X復溶液混勻，混合30s；

4、 取50µl用于分析。

5、 樣本稀釋倍數：20

（b）牛奶

1、取1ml牛奶樣本于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，去除上層脂肪。

2、取50µl上清液，加入950µl  的1X復溶液混勻，混合30s

3、取50µl液體用于分析。

          樣本稀釋倍數：20倍 

【酶標免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，每孔加酶50µl，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。

5、 取出酶標板，將孔內液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

1、粗略判定：

      用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中卡那霉素實際濃度。        

2、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以卡那霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中卡那霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

卡那霉素(ppb) [µg/kg]

圖1：卡那霉素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV 

            0       0.1    0.3   0.9   2.7    8.1

      圖2：卡那霉素檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出卡那霉素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應卡那霉素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。

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