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蛋白提取相關(guān)知識(shí)介紹

蛋白作為生命活動(dòng)的基本功能單位， 是經(jīng)典的生物標(biāo)志物， 常用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）、蛋白質(zhì)免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）實(shí)驗(yàn)等。為了實(shí)現(xiàn)我們的研究目的， 需要將蛋白從細(xì)胞組織中提取分離出來(lái)， 這一過(guò)程即為蛋白提取，提取出高質(zhì)量的蛋白是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的先決條件。

在分離之前， 需要用一定的方式進(jìn)行細(xì)胞裂解， 細(xì)胞裂解方法包括化學(xué)裂解、酶裂解和機(jī)械裂解。化學(xué)裂解和酶裂解（包括SDS和溶菌酶處理等） 通常是比較溫和的方法， 通常會(huì)很少使DNA斷裂，是提取純化蛋白時(shí)常用的方法。機(jī)械裂解可以更均一的裂解細(xì)胞， 同化學(xué)裂解相比， 機(jī)械處理更劇烈和更全面， 具有更高的裂解效率和更低的選擇性，但也會(huì)造成DNA的斷裂。

常用的蛋白類型

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)定位的不同一般可以分為總蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白、核蛋白。在提取過(guò)程中要注意以下事項(xiàng)：

1. 膜蛋白

通過(guò)勻漿適度破碎細(xì)胞， 經(jīng)低速離心去除細(xì)胞核和少數(shù)未破碎的細(xì)胞產(chǎn)生的沉淀， 隨后取上清高速離心獲得細(xì)胞膜沉淀和含有細(xì)胞漿蛋白的上清， 然后通過(guò)優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑從沉淀中抽提獲取膜蛋白。抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜等上的膜蛋白。

2. 胞漿蛋白

在低滲透壓條件下， 使細(xì)胞充分膨脹， 然后破壞細(xì)胞膜， 釋放出細(xì)胞漿蛋白，選用合適的抽提試劑進(jìn)行提取操作。

3. 核蛋白

在低滲透壓條件下， 使細(xì)胞充分膨脹破壞細(xì)胞膜后， 通過(guò)離心得到細(xì)胞核沉淀，通過(guò)高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。

不同樣本類型的提取方法（以總蛋白為例）

1. 培養(yǎng)的細(xì)胞

(1) 貼壁細(xì)胞

① 倒掉培養(yǎng)液，將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）；

② 每瓶細(xì)胞（一般需要5*10 6細(xì)胞） 加預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）清洗后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次， 共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上；

③ 每瓶細(xì)胞加含PMSF的裂解液， 于冰上充分裂解，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)；

④ 裂解完后， 用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快）， 然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至新的離心管中（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行）；

⑤ 于4℃下12000rpm離心20min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）；

⑥ 將離心后的上清分裝，于－80℃保存。

(2) 懸浮細(xì)胞

離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。

(3) 加藥的貼壁細(xì)胞

由于受藥物的影響， 一些細(xì)胞脫落下來(lái)，所以除按貼壁細(xì)胞操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：

① 將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min；

② 棄上清，加入PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次；

③ 用槍吸干上清后， 加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解， 裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解；

④ 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心20min，取上清分裝并置于－80℃保存。

2. 組織細(xì)胞

組織樣品的蛋白抽提時(shí)，必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑cocktail），操作如下：

(1) 將少量剪碎的組織塊置于玻璃勻漿器中， 加入裂解液裂（含PMSF）進(jìn)行冰上勻漿。

(2) 充分裂解后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心20min，取上清分裝并置于－80℃保存。

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